氣相液氮罐建立樣本庫(kù)推動(dòng)個(gè)性化醫(yī)療發(fā)展

　　1樣本定義

　　特定疾病(如腫瘤、心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病)患者的血液或組織相關(guān)生物標(biāo)志物的鑒定，有益于疾病的早期檢測(cè)，預(yù)防和治療。生物標(biāo)志物可用于疾病的診斷、患者預(yù)后的預(yù)測(cè)、個(gè)性化醫(yī)療的承諾。篩選樣本中存在特定基因突變的患者接受個(gè)性化治療。例如，對(duì)非小細(xì)胞肺癌進(jìn)行EGFR突變檢測(cè)，來判斷患者腫瘤樣本中是否存在EGFR突變，如果存在，患者可接受個(gè)性化的治療，使用抗表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑，如吉非替尼(gefitinib)和厄洛替尼(erlotinib )進(jìn)行治療[1、2]，而BRAFV600突變陽(yáng)性的黑色素瘤患者使用BRAF抑制劑維羅非尼(vemurafenib)治療[3]。個(gè)性化醫(yī)療為每個(gè)患者提供毒性最小的最適療法，這有賴于易得可用的高質(zhì)量、信息完整的人類生物樣本。

　　人類生物樣本包括組織、血液、尿液、骨髓及其它體液，它們是胚系DNA，RNA，蛋白質(zhì)和其他代謝物的來源，為基因組研究和生物標(biāo)志物發(fā)展所需求。存儲(chǔ)人類生物樣本和相關(guān)的患者臨床資料，可促進(jìn)未來在治療和生物標(biāo)志物發(fā)展方面的轉(zhuǎn)化研究，這也是加強(qiáng)個(gè)性化醫(yī)療所必須。為了個(gè)性化醫(yī)療學(xué)奠定基礎(chǔ)，生物樣本庫(kù)應(yīng)該通過大規(guī)模的研究充分地獲得可靠的結(jié)果。比如癌癥基因組圖譜計(jì)劃(TCGA)經(jīng)過大量的努力，已經(jīng)成功對(duì)許多癌癥樣本進(jìn)行分析研究，幫助編錄了不同腫瘤類型中存在的實(shí)變譜，其中包括卵巢癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺鱗狀細(xì)胞癌，透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌 。此外，通過貯存生物樣本，使得運(yùn)用新技術(shù)、新方法對(duì)庫(kù)存樣本進(jìn)行檢測(cè)成為可能，為未來提供更深入的了解，尤其是現(xiàn)在運(yùn)用新一代測(cè)序技術(shù)，為廉價(jià)且高效對(duì)全基因組進(jìn)行測(cè)序提供了一個(gè)強(qiáng)大的工具。

　　合理地收集、處理、貯存和追蹤生物樣本是生物樣本庫(kù)運(yùn)行至關(guān)重要的部分，生物樣本庫(kù)的流程首先是獲得參與者的知情同意，然后再進(jìn)行樣本采集。組織樣本可采集于接受手術(shù)或病理活檢的患者。其他的體液如尿液、血液和唾液可在臨床治療中收集。樣本收集后需進(jìn)行處理、分裝并凍存于適合長(zhǎng)期冰凍保存的容器中。患者的臨床信息須存儲(chǔ)于安全的數(shù)據(jù)庫(kù)中并與庫(kù)存樣本相關(guān)聯(lián)。最后，樣本和患者數(shù)據(jù)的分發(fā)必須遵循倫理規(guī)則。生物樣本庫(kù)的實(shí)際運(yùn)行是高度復(fù)雜的，包括許多技術(shù)、法律、倫理和其他問題并要求通力協(xié)作[ 9 ， 10 ]。生物樣本庫(kù)的運(yùn)行和管理通常需要標(biāo)準(zhǔn)化專業(yè)技術(shù)、質(zhì)量控制、信息技術(shù)、法律、法規(guī)、臨床和病理知識(shí)。支持個(gè)性化醫(yī)療的生物樣本庫(kù)涉及到患者護(hù)理并要求最高的操作標(biāo)準(zhǔn)、嚴(yán)格的質(zhì)量保證與質(zhì)量控制。一旦生物樣本被測(cè)序且可行性結(jié)果將被反饋到臨床實(shí)踐，這些類型的生物樣本庫(kù)應(yīng)被視為臨床生物樣本庫(kù)，且要求通過認(rèn)證，如美國(guó)病理醫(yī)生協(xié)會(huì)(CAP)認(rèn)可。[ 11 ]。

　　2.生物樣本的采集與處理

　　生物樣本應(yīng)采集于獲得知情同意的患者，知情同意提供了生物樣本庫(kù)項(xiàng)目和研究的詳細(xì)說明，包括闡述所有程序、參與者的作用、利益描述、合理的可預(yù)見風(fēng)險(xiǎn)、并傳達(dá)參與的自愿性[ 12 ]。建設(shè)生物樣本庫(kù)，獲得患者知情同意是一個(gè)必須考慮的重要問題，聯(lián)邦法規(guī)如共同規(guī)則和健康保險(xiǎn)攜帶和責(zé)任法案(HIPPA法案)要求知情同意書應(yīng)使用受試者能夠理解的通俗易懂的語(yǔ)言[ 13 ， 14 ]。廣泛的知情同意允許生物樣本庫(kù)貯存樣本，用于將來未明確的研究，這更大程度上是一種全面知情同意，有利于生物樣本庫(kù)的長(zhǎng)遠(yuǎn)目標(biāo)。廣泛的同意， 通常要求機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)(IRB)批準(zhǔn)兩個(gè)方案：一個(gè)是生物樣本庫(kù)的樣本收集方案，另一個(gè)是樣本需求和使用的研究方案。知情同意書還應(yīng)包括有關(guān)生物樣本庫(kù)參與者將來能否被再次聯(lián)系?生物樣本是否可與不屬于樣本采集機(jī)構(gòu)的外部研究人員分享?以及生物樣本是否可用于基因檢測(cè)等內(nèi)容?此外，隨著新的高通量檢測(cè)技術(shù)如下一代測(cè)序的興起，患者的知情同意應(yīng)當(dāng)闡明處理偶然發(fā)現(xiàn)的程序等。

　　生物樣本包括組織、血液、尿液、骨髓和其他體液。固體組織來源于常規(guī)臨床活檢或外科手術(shù)，需由病理醫(yī)生在其指導(dǎo)下進(jìn)行采集。病理醫(yī)生在決定分配組織用于診斷或樣本庫(kù)貯存上起著必不可少的作用。具體來說，當(dāng)固體腫瘤組織離開患體時(shí)，應(yīng)由病理醫(yī)生或其助手仔細(xì)進(jìn)行大體檢查，并由病理醫(yī)生決定切割組織的關(guān)鍵部份用于常規(guī)病理診斷，且在不影響常規(guī)病理診斷的情況下，組織的剩余部份才能被生物樣本庫(kù)切割收集。有時(shí)在作出最終診斷之前，分配給生物樣本庫(kù)的組織需保留在病理實(shí)驗(yàn)室。

　　快速采集和高效處理對(duì)于高質(zhì)量的組織生物樣本庫(kù)是必不可少的。組織樣本從手術(shù)室轉(zhuǎn)運(yùn)至病理實(shí)驗(yàn)室的效率、采集前的病理學(xué)評(píng)估和處理是保持其質(zhì)量的關(guān)鍵步驟。大量的研究表明長(zhǎng)時(shí)間的體外缺血影響樣本在RNA和蛋白質(zhì)水平的質(zhì)量，并有可能影響研究結(jié)果[1 6 ， 1 7 ]。因此，一旦組織離體，病理醫(yī)生及生物樣本庫(kù)工作人員應(yīng)盡可能快地完成大體檢查和樣本處理。理想的時(shí)間是在30分鐘內(nèi)，可避免組織體外缺血時(shí)間的延長(zhǎng)。除了組織的生物分子質(zhì)量外，后續(xù)通常需要病理醫(yī)生對(duì)庫(kù)存組織的冷凍切片進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析以評(píng)估組織學(xué)質(zhì)量。這個(gè)過程包括確認(rèn)病理診斷、組織異質(zhì)性、組織評(píng)分、腫瘤細(xì)胞的存在或缺失、炎癥和壞死面積等。庫(kù)存組織的病理學(xué)分析應(yīng)當(dāng)與患者的原始病理診斷相關(guān)聯(lián)，當(dāng)最初的病理診斷與庫(kù)存組織診斷發(fā)生差異時(shí)，庫(kù)存冷凍組織需被發(fā)放用于后續(xù)的診斷分析以確保常規(guī)診斷的正確完成。樣本庫(kù)收集新鮮冷凍組織用于貯存應(yīng)當(dāng)進(jìn)行切分、速凍、并貯存于?80°C或液氮柜中，避免反復(fù)凍融保持生物樣本的完整性。生物樣本庫(kù)也可收集經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋的組織塊(FFPE)進(jìn)行貯存，但其相應(yīng)的H&E切片需由病理醫(yī)生進(jìn)行檢測(cè)以判斷腫瘤或病變組織的面積和數(shù)量并由樣本庫(kù)收集、貯存。

　　除組織外，血液是最易獲得并在臨床和轉(zhuǎn)化研究中被廣泛使用的生物樣本類型之一，血液的采集和貯存沒有組織復(fù)雜。采集的血液應(yīng)分離成血漿、血清、血沉棕黃層和紅細(xì)胞，分別貯存使樣本的價(jià)值最大化。根據(jù)下游研究目的不同，血漿和血沉棕黃層收集于不同的抗凝管中，如乙二胺四乙酸(EDTA)鹽， 枸櫞酸鹽和肝素抗凝管。EDTA鹽抗凝管廣泛適用基于DNA和蛋白的研究 [ 18 ]，肝素抗凝的血漿通常用于代謝組學(xué)研究(18、19)。枸櫞酸鹽抗凝管對(duì)淋巴細(xì)胞有很高的得率，所以使用枸櫞酸鹽葡萄糖抗凝管收集外周血單個(gè)核細(xì)胞(18、20)。血沉棕黃層可長(zhǎng)期貯存作為DNA和RNA來源的樣本，從而取代血液在采集時(shí)就立即分離核酸。研究表明，從血沉棕黃層提取的胚系DNA可廣泛應(yīng)用于生物標(biāo)志物的研究(21、22)。血清收集于含有二氧化硅和凝血酶等促凝劑的試管中，用于臨床生化檢測(cè)和代謝組學(xué)研究[18]。英國(guó)生物樣本庫(kù)有一個(gè)全面的血液采集程序，將血液收集于不同的抗凝管和血清分離管中[ 18 ]。此外，血液中來源于癌癥的物質(zhì)如循環(huán)腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞游離循環(huán)腫瘤DNA等正成為廣受歡迎的生物樣本類型。原發(fā)和/或轉(zhuǎn)移的腫瘤將循環(huán)腫瘤細(xì)胞播散于循環(huán)系統(tǒng)，與此同時(shí)DNA片斷從死亡細(xì)胞脫落進(jìn)入血流[23]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞游離循環(huán)腫瘤DNA可被分離并用于跟蹤疾病的進(jìn)展。因此，貯存此類基于血液的樣本為發(fā)展個(gè)性化治療提供了非常有用的資源。尿液是另一種容易獲得的生物樣本，已被廣泛用于研究蛋白、核酸或細(xì)胞?；颊呖勺孕惺占迈r尿液于潔凈容器中，如已有導(dǎo)尿管也可從從導(dǎo)尿管中收集。收集后，應(yīng)當(dāng)作全尿分裝并立即凍存。分裝的尿液也可離心將沉渣和上清分別貯存在?80 °C或液氮中。此外，唾液、腦脊液、胸水和腹水、胃灌洗、頰粘膜涂片和宮頸涂片也被認(rèn)為是有價(jià)值的樣本而被收集和貯存。此類體液樣本可全樣分裝或通過離心富集細(xì)胞，將沉積的細(xì)胞和上清液分別貯存。和組織樣本相類似，體液樣本采集后應(yīng)盡快處理并長(zhǎng)期冷凍貯存在?80 °C或液氮中。早期檢測(cè)研究網(wǎng)絡(luò)(EDRN)對(duì)于血漿和血清采集的標(biāo)準(zhǔn)操作程序建議EDTA鹽抗凝的血漿應(yīng)立即處理或處理之前4°C保存不超過4 h，血清30–60 min形成凝塊后進(jìn)行離心處理或4°C不超過幾個(gè)小時(shí)[24]。隨著新的分析技術(shù)的進(jìn)步，生物樣本的類型及收集方法也將繼續(xù)發(fā)展。

　　3.生物樣本的貯存與分發(fā)

　　盡管某些類型的生物樣本如FFPE組織塊和切片可以存儲(chǔ)在室溫下，但是大多數(shù)生物樣本庫(kù)保存新鮮冷凍樣本，以保持核酸和蛋白質(zhì)高度完整性，因此，生物樣本通常貯存在?80°C或氣相液氮罐罐中，使其在用于實(shí)驗(yàn)和分析前保持良好的狀態(tài)。固體組織樣本可以不同的方式保存。組織用液氮快速冷凍或包埋在OCT介質(zhì)中然后速凍放?80°C或氣相液氮罐罐中長(zhǎng)期保存。FFPE組織及保存在RNAlater或PAXgene中的組織，在使用前可在室溫短期保存，但是長(zhǎng)期保存應(yīng)該存儲(chǔ)在?20°C或更冷的環(huán)境下。多項(xiàng)研究表明， 反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致組織和血液中RNA的完整性下降且血清和血漿蛋白質(zhì)組變化顯著 (25 - 28)。因此冷凍組織應(yīng)分裝后貯存以避免反復(fù)凍融。很少有關(guān)于生物樣本貯存在液氮是否比貯存在?80°C更好的信息。然而一些研究表明，樣本貯存在-70或?80°C五年，其RNA的完整性降低(29，30)。盡管血漿貯存在?70°C 59個(gè)月，蛋白質(zhì)未見降解[31]，如果可能的話，同一患者的樣本應(yīng)分裝保存于兩個(gè)不同環(huán)境中(?80 °C和氣相液氮罐罐)以保護(hù)生物樣本庫(kù)免受損失并保持生物樣本的質(zhì)量，應(yīng)首先使用貯存在?80°C冰箱中的生物樣本，氣相液氮罐罐中貯存的樣本作為“備份”，當(dāng)?80°C冰箱的樣本用完后再使用。

　　生物樣本長(zhǎng)期低溫貯存的容器通常用螺帽凍存管。正確標(biāo)識(shí)存有樣本的凍存管對(duì)確保正確識(shí)別生物樣本是重要的。帶有條形碼的標(biāo)簽可以鏈接生物樣本和記錄在數(shù)據(jù)庫(kù)中數(shù)據(jù)并提供有效的標(biāo)識(shí)方法。貯存在?80°C和液氮中的凍存管應(yīng)用耐受冷凍保存的條形碼標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)識(shí)，以防止開裂，剝落或老化。生物樣本的唯一編碼(ID)、樣本類型、存放于冰箱的位置以及與患者相關(guān)的個(gè)人資料和臨床信息應(yīng)集中存儲(chǔ)在一個(gè)安全的計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)中并經(jīng)常備份?，F(xiàn)有的生物樣本庫(kù)最佳實(shí)踐(如ISBER的生物樣本庫(kù)最佳實(shí)踐和NCI的生物樣本資源最佳實(shí)踐)可作為地方標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程建立的指南和參考[ 32 ， 33 ]。最近，美國(guó)病理醫(yī)生協(xié)會(huì)(CAP)開展了生物樣本管理標(biāo)準(zhǔn)化活動(dòng)即CAP的生物樣本庫(kù)認(rèn)可程序。CAP的生物樣本庫(kù)認(rèn)可檢查表提高供了詳細(xì)的認(rèn)或要求發(fā)確保生物樣本庫(kù)實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程、質(zhì)量保證、質(zhì)量控制程序。CAP認(rèn)可致力于質(zhì)量、精度及程序的一致性，這有助于顯著提高高生物樣本庫(kù)的價(jià)值和質(zhì)量并保持生物樣本庫(kù)高標(biāo)準(zhǔn)地運(yùn)行。生物樣本庫(kù)對(duì)個(gè)性化醫(yī)療的支持，涉及直接患者治療，需要這樣的認(rèn)可過程來符合公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)。

　　生物樣本庫(kù)的基礎(chǔ)設(shè)施和可訪問性直接影響著個(gè)性化醫(yī)療。為了能可靠地獲得高質(zhì)量且具有患者臨床資料的生物樣本，應(yīng)形成便捷可達(dá)的方法來協(xié)助查找有信息備注的樣本。信息技術(shù)對(duì)生物樣本庫(kù)數(shù)據(jù)管理和生物樣本訪問起著重要的作用。生物樣本庫(kù)信息管理系統(tǒng)的主要功能是追蹤生物樣本的收集、處理、貯存和分發(fā)，管理患者信息，并給客戶提供查詢樣本的功能?；颊叩幕拘畔?、病理診斷、樣本類型和貯存位置通常是數(shù)據(jù)庫(kù)中的基本數(shù)據(jù)元素。特定的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)，例如，乳腺癌的ER、PR和Her2/neu，非小細(xì)胞肺癌的EGFR突變情況，黑色素瘤的BRAF實(shí)變狀況及隨訪結(jié)果的數(shù)據(jù)變得越來越重要，應(yīng)該捕獲并存儲(chǔ)在中央生物樣本數(shù)據(jù)庫(kù)中。精準(zhǔn)的生物樣本庫(kù)存和相關(guān)的臨床資料可以明顯減少巨量的生物樣本查找和檢索任務(wù)并增強(qiáng)庫(kù)存生物樣本的價(jià)值。網(wǎng)絡(luò)搜索工具可協(xié)助查詢具有信息的生物樣本，將使生物樣本庫(kù)更易具訪問性(34、35)。為保護(hù)病人隱私和機(jī)密，生物樣本庫(kù)應(yīng)作為一個(gè)誠(chéng)實(shí)的中間方，將所有數(shù)據(jù)存儲(chǔ)在受密碼保護(hù)的電腦中，電腦受機(jī)構(gòu)安全服務(wù)器的支持[ 34 ， 36 ]。受保護(hù)的健康信息在發(fā)布或披露給任何其他人或機(jī)構(gòu)時(shí)，將僅包括有限數(shù)據(jù)集的應(yīng)用，附上IRB批準(zhǔn)的數(shù)據(jù)使用協(xié)議，也可要求一份明確的患者同意。所有發(fā)布的數(shù)據(jù)應(yīng)該有一個(gè)發(fā)布編碼，如，生物樣本的參考號(hào)，以便宜樣本庫(kù)工作人員再次將數(shù)據(jù)與樣本鏈接并追蹤數(shù)據(jù)的來源。

　　生物樣本庫(kù)的運(yùn)行應(yīng)接受來自多學(xué)科咨詢委員會(huì)的指導(dǎo)。委員會(huì)應(yīng)由外科、病理學(xué)、基礎(chǔ)科學(xué)、臨床科學(xué)、生物統(tǒng)計(jì)學(xué)、生物倫理學(xué)和其他相關(guān)領(lǐng)域的代表組成。咨詢委員會(huì)旨在引導(dǎo)政策、評(píng)估生物樣本需求以確保他們的科學(xué)價(jià)值并優(yōu)先分配資源，使人們公平地獲得具有價(jià)值但又有限的生物樣本。生物樣本庫(kù)花費(fèi)多年的時(shí)間收集樣本、獲取隨訪的臨床信息需要充足的人員，包括病理學(xué)支持、管理和技術(shù)人員。生物樣本庫(kù)基礎(chǔ)設(shè)施的投資和運(yùn)營(yíng)經(jīng)費(fèi)是一個(gè)重要的保證。即使是建造和運(yùn)營(yíng)一個(gè)小的生物樣本庫(kù)也是昂貴的(37、38)。因此，應(yīng)該得到機(jī)構(gòu)長(zhǎng)期支持并實(shí)施收費(fèi)機(jī)制使生物樣本庫(kù)長(zhǎng)期可持續(xù)性發(fā)展。因?yàn)樯飿颖編?kù)直接涉及患者治療支持個(gè)性化醫(yī)療，可最終要求患者健康保險(xiǎn)公司付費(fèi)，這類生物樣本庫(kù)需要特定的認(rèn)可[39]。

　　4.質(zhì)量保證與質(zhì)量控制

　　個(gè)性化醫(yī)療時(shí)代的成功生物樣本庫(kù)，其最重要的方面是生物樣本的質(zhì)量。使用劣質(zhì)的生物樣本進(jìn)行的研究將可能產(chǎn)生錯(cuò)誤和誤導(dǎo)性的數(shù)據(jù)。質(zhì)量保證和質(zhì)量控制對(duì)生物樣本庫(kù)的運(yùn)行極其重要。生物樣本庫(kù)應(yīng)有文件化的質(zhì)量管理程序和詳細(xì)的SOPs，確保生物樣本庫(kù)服務(wù)和運(yùn)行的質(zhì)量。SOPs應(yīng)詳細(xì)以便工作人員容易遵循并準(zhǔn)確地執(zhí)行其中的方法，并定期對(duì)庫(kù)存生物樣本實(shí)施質(zhì)量評(píng)估程序。隨著近來新的高通量“組學(xué)”平臺(tái)技術(shù)的加速，增加對(duì)生物樣本在DNA、RNA和蛋白水平的要求，庫(kù)存新鮮冷凍組織保持核酸和蛋白質(zhì)的高度完整性變得越發(fā)重要。因此，合理地處理和鑒定生物樣本對(duì)高質(zhì)量的生物樣本庫(kù)的發(fā)展和管理至關(guān)重要。

　　使用分光光度計(jì)和變性瓊脂糖凝膠檢測(cè)人類總RNA提取質(zhì)量。分光光度計(jì)在260 和280 nm (A260：A280) 讀數(shù)的比值大于1.8表示的RNA純度可接受[40]。完整的RNA，瓊脂糖凝膠電泳有兩個(gè)明顯的條帶分別對(duì)應(yīng)于28S和18S核糖體RNA(rRNA)。RNA完整度可以通過測(cè)量28S、18S核糖體RNA的比值獲得。28S/18S大于等于2被認(rèn)為是高質(zhì)量的RNA，而通常28S：18S > 1.0，RNA可被視為質(zhì)量好[ 41 ]。由于這種方法主觀且依賴于凝膠圖像判讀。新開發(fā)的自動(dòng)化RNA質(zhì)量測(cè)量設(shè)備，即RNA完整數(shù)(RIN)得到了廣泛的應(yīng)用[ 42 ， 43 ]。RIN是由軟件計(jì)算生成，是用戶對(duì)RNA質(zhì)量控制的獨(dú)立、自動(dòng)和可靠的標(biāo)準(zhǔn)化程序[42]。最近，RIN e被開發(fā)并設(shè)計(jì)使用在安捷倫TapeStation平臺(tái)上，但RIN e的值相當(dāng)于RIN值[44] 。RIN或RIN e值的范圍從10到1， 通過指定完整的高質(zhì)量RNA其RIN或RIN e值為10。高質(zhì)量RNA的特點(diǎn)是有兩個(gè)清晰、輪廓完好的28S和18S峰，且兩峰間無干擾雜峰，在18S峰前有最小分子量干擾雜峰(圖1.)。通常RIN大于等于5被認(rèn)為是高質(zhì)量RNA，適用于RT-PCR分析[ 45 ， 46 ]。從FFPE組織或其他不同方式保存的樣本(如乙醇固定)抽提RNA通常要求嚴(yán)格的質(zhì)量保證和質(zhì)量控制程序，使用安捷倫Bioanalyzer 或TapeStation得出的RIN T和RINe 值不能很好的評(píng)估分離自FFPE組織的RNA。為了準(zhǔn)確地評(píng)估FFPE的RNA質(zhì)量，在管家基因beta-actin上游和下游末端的兩組引物，用于實(shí)時(shí)PCR分析。3′末端到 5′末端PCR產(chǎn)物的較低比值表明RNA的質(zhì)量高[ 11 ]。

　　圖1. RNA質(zhì)量控制。

　　從組織和血液中提取的RNA質(zhì)量使用安捷倫TapeStation進(jìn)行了分析。

　　(a) 一例高質(zhì)量RNA，顯示了高RIN e(RIN e = 9.4)，18S和28S rRNA峰清晰可見，和在18S 和28S峰之間極低的干擾雜峰。

　　(b) 下一組顯示部分降解RNA，低RIN e(RIN e = 5.9) (RIN e = 5.9)，兩峰之間和18S峰前高干擾雜峰。

　　(c) a和b的RNA，凝膠圖像相同

　　從庫(kù)存樣本抽提的DNA通常用分光光度法測(cè)量，如用Nanodrop判斷DNA的量和純度。RNA的測(cè)量也一樣，分光光度法測(cè)量260 和 280 nm (A260：A280)的讀數(shù)的比值大于1.8表明DNA的純度是可接受的。為了評(píng)估DNA的質(zhì)量，看管家基因的幾套引物如：β-globin可用來擴(kuò)增不同長(zhǎng)度的片斷，最大擴(kuò)增片斷的大小與DNA質(zhì)量成正相關(guān)。 最近，開發(fā)的安捷倫TapeStation提供一步法評(píng)估DNA的數(shù)量和質(zhì)量 [47]。用TapeStation檢測(cè)，高質(zhì)量的DNA呈清晰的單條帶，而降解的DNA呈彌散狀大小不等的片段條帶(圖2. )。從血沉棕黃層及其他非組織生物樣本(血液、血液分離物、尿液等)提取的DNA和RNA 的完整度可用同樣的方法檢測(cè)，以評(píng)估非組織樣本的質(zhì)量。

　　圖2. DNA質(zhì)量控制。從組織和血液中提取的DNA質(zhì)量使用安捷倫TapeStation進(jìn)行分析

　　(a)一個(gè)高質(zhì)量DNA例子，用安捷倫TapeStation顯示一個(gè)大片段的DNA外觀。

　　(b)低質(zhì)量的DNA，用安捷倫TapeStation顯示生成DNA片段彌散。、

　　(c)a和b的DNA，凝膠圖像相同

　　蛋白質(zhì)定量的幾種不同分析方法有二辛可寧酸法、Lowry蛋白分析法、Bradford法來測(cè)定蛋白質(zhì)濃度以及SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后考馬斯藍(lán)染色以確定蛋白質(zhì)組的完整性。特定的抗原包括磷酸化的蛋白質(zhì)可以用免疫印跡和免疫組織化學(xué)染色鑒定。由于這些蛋白質(zhì)質(zhì)量評(píng)價(jià)方法通常并非經(jīng)濟(jì)有效。最好留給終端研究者， 根據(jù)其具體的應(yīng)用和分析流程去實(shí)施他們自己的蛋白質(zhì)質(zhì)量評(píng)估。同樣地，血漿、血清及其他的體液的質(zhì)量保證和質(zhì)量控制主要依賴于研究者的反饋。選擇的參數(shù)(如采樣與凍存之間有時(shí)間間隔、貯存溫度、貯存期限有及可接受的凍融循環(huán)次數(shù))形成文件對(duì)于體液的質(zhì)量保證是重要的。其他的實(shí)驗(yàn)室活動(dòng)如文件控制、記錄控制、內(nèi)部審核和糾正、預(yù)防措施對(duì)生物樣本庫(kù)的質(zhì)量管理程序也很重要。

　　5.病理醫(yī)生在生物樣本庫(kù)中的作用

　　病理醫(yī)生在生物樣本庫(kù)中的作用已得到很好的認(rèn)可(48 - 50)。因?yàn)椴±磲t(yī)生的作用在于在檢查人體組織以便診疾病的診斷或治療。只有病理醫(yī)生了解組織的哪一部份需要用于診斷，哪一部份能夠用于生物樣本庫(kù)保存。由于大多數(shù)固體癌組織標(biāo)本是由由不同成分的細(xì)胞類型組成的(如腫瘤、癌旁正常，基質(zhì)、炎癥細(xì)胞等);提交給生物標(biāo)本庫(kù)的固體腫瘤組織應(yīng)當(dāng)由病理醫(yī)生檢查以確定樣本的組織學(xué)特征。最近的一項(xiàng)研究表明，由外科醫(yī)生或病理醫(yī)生助理明確指定的腫瘤和癌旁正常組織要求病理醫(yī)生進(jìn)行研究顯微鏡檢查，因?yàn)樘峁┑哪[瘤樣本是正常和腫瘤組織的混合物，而正常組織實(shí)際上是腫瘤[43]。因此，組織樣本的組織學(xué)質(zhì)量控制必須由一個(gè)病理醫(yī)生執(zhí)行，對(duì)庫(kù)存生物樣本的組織切片進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢查(圖3.a )。固體組織最低限度的質(zhì)量控制至少應(yīng)當(dāng)制作組織切片鏡檢[ 51 ]。對(duì)于某些浸潤(rùn)性方式生長(zhǎng)類型的腫瘤如胰腺癌、前列腺癌組織， 質(zhì)量控制要求連續(xù)低溫恒溫切片。OCT包埋的冷凍組織塊的最前部份應(yīng)當(dāng)切片、H&E染色用于組織學(xué)檢查，留取部分用于核酸的抽提。其最后的部份切片、H&E染色以證實(shí)腫瘤的存在。

　　組織學(xué)質(zhì)量控制報(bào)告應(yīng)該包括病理診斷證據(jù)、疾病狀態(tài)、腫瘤純度的評(píng)估、正常、基質(zhì)、壞死細(xì)胞以及炎癥細(xì)胞等百分比的記錄。重要的是確保生物樣本庫(kù)貯存的組織生物樣本(腫瘤或正常)準(zhǔn)確地記錄在數(shù)據(jù)庫(kù)中。此外，隨著分子生物學(xué)技術(shù)靈敏度的增加，不同的結(jié)果可能代表占主導(dǎo)地位細(xì)胞類型而不是感興趣的細(xì)胞類型(如。腫瘤細(xì)胞)。大部分實(shí)體腫瘤組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜，是由形態(tài)和功能上獨(dú)特的細(xì)胞類型(如腫瘤、正常、基質(zhì)細(xì)胞)異質(zhì)混合組成的。為了減少組織內(nèi)異質(zhì)性，在RNA/DNA/蛋白抽提用于下游分析前，通常需用手工大切割或激光捕獲顯微切割來選擇感興趣的特定細(xì)胞(如，腫瘤細(xì)胞)，以增強(qiáng)特定細(xì)胞的純度[52 ]。無論是大切割還是激光捕獲顯微切割都要求病理醫(yī)生的專業(yè)技術(shù)去識(shí)別特殊細(xì)胞類型(腫瘤和正常細(xì)胞)，并使得腫瘤和/或正常細(xì)胞由生物樣本庫(kù)技術(shù)員進(jìn)行大切割或微切割(圖3. b，c)

　　圖3.組織的組織學(xué)質(zhì)量控制和優(yōu)化。

　　(a) 一例卵巢腫瘤組織OCT塊的H&E片，經(jīng)病理確診，腫瘤、正常、壞死等的百分比經(jīng)病理醫(yī)生評(píng)估。

　　(b) 核酸提取之前，大切割腫瘤富集部位。

　　(c)一例子卵巢腫瘤組織，腫瘤小于10%，核酸提取之前，使用激光捕獲微切割腫瘤。

　　組織微陣列(TMA)能夠同時(shí)快速地對(duì)大批組織樣本進(jìn)行形態(tài)學(xué)評(píng)估。與免疫組化，原位雜交和熒光原位雜交(FISH)分析相結(jié)合，TMA為高通量篩選靶向分子、促進(jìn)從發(fā)現(xiàn)分子到臨床應(yīng)用的快速轉(zhuǎn)化提供了一個(gè)強(qiáng)大的工具[53、54]。庫(kù)存的樣本是構(gòu)建TMA的巨大資源，因此TMA技術(shù)結(jié)合可用的庫(kù)存生物標(biāo)本可以大大有助于腫瘤分析、生物標(biāo)志物鑒定和驗(yàn)證。TMA塊是通過將腫瘤組織從許多石蠟塊或OCT塊轉(zhuǎn)移到單個(gè)的TMA接受塊制備而成。病理醫(yī)生應(yīng)當(dāng)對(duì)來源于原始蠟塊或OCT包埋塊的H&E片進(jìn)行檢驗(yàn)，確定合適的腫瘤灶并將其轉(zhuǎn)移到TMA接收塊中。TMA切片用H&E或其他特殊染色后，由病理醫(yī)生對(duì)多個(gè)病人的腫瘤樣本同時(shí)進(jìn)行原位分析(圖4.) 。在個(gè)性化醫(yī)療時(shí)代，對(duì)用于TMA分析和高通量技術(shù)如基因組和蛋白質(zhì)組的分析的腫瘤組織有很高的要求，需具有高質(zhì)量、完整的臨床信息。在生物樣本庫(kù)的運(yùn)行和管理中，病理醫(yī)生提供了獨(dú)特的專業(yè)技術(shù)，因此他們是重要的貢獻(xiàn)者。

　　圖4.生物樣本庫(kù)的組織芯片

　　(a) 一例前列腺TMA塊，包含多個(gè)病人腫瘤組織。從TMA塊切片、H&E染色，病理醫(yī)生作形態(tài)分析后，進(jìn)行免疫組織化學(xué)和原位雜交試驗(yàn)，，對(duì)大量的腫瘤組織樣本進(jìn)行物高通量的生物標(biāo)志物分析。

　　(b) TMA有代表性的芯

　　6.全基因組和外顯子測(cè)序

　　新的下一代高通量測(cè)序正迅速成為分子遺傳學(xué)分析的標(biāo)準(zhǔn)。人類全基因組的和全外顯子組測(cè)序有望終將徹底改變醫(yī)療實(shí)踐。下一代測(cè)序能迅速而廉價(jià)對(duì)每個(gè)腫瘤的全基因組和全外顯子測(cè)序，正改變著腫瘤學(xué)的實(shí)踐，并為個(gè)性化醫(yī)療開辟了新的途徑。人們一直嘗試著基于每個(gè)患者樣本特征，通過高通量技術(shù)進(jìn)行個(gè)性化治療[ 55 ， 56 ]。下一代測(cè)序的進(jìn)展可以檢測(cè)多個(gè)基因和通路的突變，反過來，用合理的費(fèi)用生成一個(gè)全面的個(gè)體突變圖譜，這極大地促進(jìn)了人們對(duì)靶向治療的選擇。下一代DNA和RNA測(cè)序無疑需要信息完整、，高質(zhì)量的人類生物樣本[57]。使用庫(kù)存樣本進(jìn)行下一代測(cè)序所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，應(yīng)當(dāng)存放在一個(gè)安全的中央數(shù)據(jù)庫(kù)中，以便未來研究使用。測(cè)序數(shù)據(jù)連同患者的臨床信息為新的發(fā)現(xiàn)提供了寶貴的數(shù)據(jù)資源，而無需重復(fù)采集生物樣本，從而減少了后續(xù)研究的費(fèi)用。這些數(shù)據(jù)的重復(fù)使用極大地保證了轉(zhuǎn)化與臨床研究的效率和效果。然而，如未來分析這些數(shù)據(jù)超出最初的研究范圍，應(yīng)當(dāng)納入到知情同意文件并需要一個(gè)單獨(dú)的IRB批準(zhǔn)。為了保護(hù)患者隱私和機(jī)密，患者的信息識(shí)別需要通過計(jì)算機(jī)生成的條形碼來查找，測(cè)序數(shù)據(jù)和患者臨床信息之間唯一的鏈接應(yīng)該保存在一個(gè)安全的數(shù)據(jù)庫(kù)中。全基因組和全外顯子測(cè)序以及生物樣本庫(kù)在鑒定基因變異以及基因變異與藥物療效、臨床結(jié)果之間的關(guān)系中發(fā)揮著越來越重要的作用，并為推進(jìn)個(gè)性化醫(yī)療奠定了基石、鋪平了道路。

　　7.管理偶然發(fā)現(xiàn)

　　下一代測(cè)序能夠產(chǎn)生大量數(shù)據(jù)，這些通常遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出最初研究所要求測(cè)序的數(shù)據(jù)。偶然(或附帶)的結(jié)果越來越多且不可避免。它們具有潛在的臨床意義，但與最初研究無關(guān)。盡管關(guān)于歸還基因組研究偶然發(fā)現(xiàn)有很大爭(zhēng)議，但人們建議，由CLIA(臨床實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)修正案)認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)的某些發(fā)現(xiàn)和結(jié)果，揭示了既定的或?qū)嵸|(zhì)性的嚴(yán)重健康風(fēng)險(xiǎn)，并具備臨床可操作性，這些發(fā)現(xiàn)和結(jié)果應(yīng)當(dāng)歸還給同意參與的生物樣本庫(kù)參加者(58 ，59)。美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(ACMG)推薦了最低條件，返回在臨床測(cè)序中偶然發(fā)現(xiàn)的基因和變異，其中包括為遺傳性乳腺癌和卵巢癌BRCA1和BRCA2， 家族性腺瘤息肉病的APC和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤RB1等[60]。最近，生命倫理研究總統(tǒng)委員會(huì)，白宮顧問小組建議研究人員、臨床醫(yī)師以及直接面向顧客的公司在產(chǎn)生基因組、影像或其他類型的生物醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)時(shí)應(yīng)有計(jì)劃應(yīng)對(duì)偶然發(fā)現(xiàn)，并就如何處理這些發(fā)現(xiàn)制定與患者、研究參與者和顧客溝通的計(jì)劃[ 61 ]。盡管將結(jié)果返回參與者的過程會(huì)給生物樣本庫(kù)帶來明顯的費(fèi)用，但生物樣本庫(kù)應(yīng)當(dāng)支持個(gè)性化醫(yī)療，努力建立返還偶然發(fā)現(xiàn)的責(zé)任機(jī)制。隨著個(gè)性化醫(yī)療的持續(xù)成長(zhǎng)和發(fā)展，必須實(shí)施特殊的程序或政策來決定如何處理這些發(fā)現(xiàn)。

　　8.結(jié)論

　　個(gè)性化醫(yī)療為改善患者狀況提供了真正的希望。靶向治療開始使個(gè)性化醫(yī)療在腫瘤學(xué)上成為現(xiàn)實(shí)。針對(duì)特殊患者群體的高效藥物靶向治療的例子，如Her2過度表達(dá)/擴(kuò)增的乳腺癌患者使用赫賽汀(Herceptin) [ 62 ， 63 ]，攜帶BRAF V600E突變的黑色素瘤患者使用維羅非尼(Vemurafenib)[ 62 ， 64 ]，攜帶ALK突變的非小細(xì)胞肺癌患者使用克唑替尼(Xalkori)[ 65 ]。這些生物標(biāo)志物增強(qiáng)了腫瘤學(xué)家決定使用毒性最小化的最佳治療方案的能力。生物樣本庫(kù)在新的生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)方面發(fā)揮著重要的作用，為新的個(gè)性化療法的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。生物樣本庫(kù)的發(fā)展和運(yùn)行非常復(fù)雜，需要廣泛的機(jī)構(gòu)合作、重大的制度支持。高質(zhì)量的生物樣本庫(kù)發(fā)展和運(yùn)行需要標(biāo)準(zhǔn)化專業(yè)技術(shù)、質(zhì)量控制、信息技術(shù)、法律和倫理來管理生物樣本庫(kù)實(shí)踐，還需要具備與利益相關(guān)方溝通和洽談的技巧。涉及患者治療的生物樣本庫(kù)通過采集和貯存生物樣本或衍生物用于臨床相關(guān)分子檢測(cè)是一個(gè)令人鼓舞的的活動(dòng)，但需要最高標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量保證、質(zhì)量控制和必要的認(rèn)證和認(rèn)可。大量收集帶有患者臨床信息的生物樣本，在個(gè)性化治療中有效地挖掘生物標(biāo)志物是至關(guān)重要的。同時(shí)病理醫(yī)生應(yīng)當(dāng)參與到生物樣本庫(kù)的運(yùn)行和管理中去。庫(kù)存組織的收集、質(zhì)量保證和質(zhì)量控制必須由訓(xùn)練有素的病理醫(yī)生或其指導(dǎo)下完成，以確保下游分子和基因組檢測(cè)結(jié)果的可靠性和可重現(xiàn)性。創(chuàng)新性高通量下一代測(cè)序技術(shù)正迅速成為分子基因檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)，生物樣本庫(kù)在支持個(gè)性化醫(yī)療的過程中，應(yīng)當(dāng)努力建立處理偶然發(fā)現(xiàn)的責(zé)任機(jī)制。最終，隨著個(gè)性化醫(yī)療的擴(kuò)展，在醫(yī)療中心內(nèi)為患者提高供標(biāo)準(zhǔn)化的治療，生物樣本庫(kù)將是必須的